探讨成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)基因沉默介导RAS/RAF/MAPK信号通路对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响。方法：收集本院2018年4月至2019年8月收治的口腔鳞癌患者32对肿瘤组织样本和癌旁非癌组织，利用免疫组织化学和免疫印迹检测FGFR4蛋白的表达；免疫印迹检测正常口腔上皮细胞HOEC和口腔鳞癌细胞（HSC-2、CAL-27和SACC-83）中FGFR4蛋白的表达水平。通过基因沉默技术下调FGFR4表达，利用qRT-RCR和免疫印迹检测SACC-83细胞的FGFR4表达的变化，克隆形成实验检测SACC-83细胞的增殖能力，流式细胞术检测SACC-83细胞的凋亡和细胞周期，免疫印迹检测SACC-83细胞的RAS/RAF/MAPK信号通路。结果：与癌旁非癌组织相比，口腔鳞癌组织的FGFR4表达升高；与正常口腔上皮细胞HOEC相比，口腔鳞癌细胞（HSC-2、CAL-27和SACC-83）的FGFR4表达量高；下调FGFR4表达可抑制SACC-83细胞的增殖，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调凋亡蛋白Bax的表达，促进SACC-83细胞的凋亡，同时抑制周期蛋白P21的表达，使SACC-83细胞停滞于G0/G1期；下调FGFR4表达可抑制RAS、RAF及p-MEK和p-ERK1蛋白的表达。结论：下调FGFR4表达可抑制口腔鳞癌细胞增殖，促进细胞凋亡，使其停滞于G0/G1期，可能与抑制RAS/RAF/MAPK信号通路有关。
口腔鳞癌约占所有口腔癌的90%，多种基因突变的积累会导致口腔上皮细胞发展为癌症，患者5年生存率低于50%。因此，研究口腔鳞癌的发生发展机制非常重要。研究证实，成纤维细胞生长因子受体4(fibroblastgrowthfactorreceptor4,FGFR4）在胚胎发育、血管生成中起关键作用。FGFR4在肿瘤中的高表达、多态性与肝癌的转移相关。RAS/RAF/MAPK通路能够在细胞核中激活特定的基因促进细胞生长和分化，参与肿瘤细胞增殖和凋亡。RAS是突变最频繁的致癌基因，40%食管癌患者具有RAS扩增的特点，大约50%的乳腺癌与RAS的高表达密切相关。RAF进一步促使MAPK磷酸化信号级联激活，诱导特定基因转录。蛋白激酶MAPK是RAS/RAF/MAPK通路的核心成分，在细胞增殖、分化等程序中发挥重要作用。阐明RAS/RAF/MAPK通路的调控机制有助于明确肿瘤的发展机制。FGFR4过表达可活化GRB2和SOS蛋白，进而激活RAS/RAF/MAPK通路。因此本研究探究下调FGFR4基因的表达与RAS/RAF/MAPK信号通路的调节作用及对口腔鳞癌增殖和凋亡的影响。
1材料和方法
1.1组织样本、细胞株及主要试剂
收集本院于2018年4月至2019年8月收治的口腔鳞癌患者的32对肿瘤组织样本和癌旁非癌组织。所有患者术后病理诊断为口腔鳞癌，术前未行化疗或放疗，具有完整病史记录，且所有患者已签署知情同意书。组织样本均保存于-80℃，使用时同时处理肿瘤组织及非肿瘤样本组织。人正常口腔上皮细胞HOEC购自上海弘顺生物科技有限公司；人口腔鳞癌细胞CAL-27和HSC-2均购自上海酶研生物科技有限公司；SACC-83细胞购自江阴雨汐生物科技有限公司。胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、MEM培养基和DMEM培养基、qRT-PCR试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TRIzol试剂购自上海联迈生物工程有限公司；Bcl-2、Bax、RAS、RAF、MEK、p-MEK、ERK1、p-ERK1和FGFR4抗体购自Abcam公司；二抗（羊抗兔）购自美国CST公司；显影液和定影液购自碧云天生物科技有限公司；细胞周期检测试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司。
1.2细胞培养
人正常口腔上皮细胞HOEC用RPMI-1640(15%胎牛血清）培养基在37℃、5%CO2的条件下于培养箱中培养；SACC-83细胞用MEM(15%胎牛血清）培养基在37℃、5%CO2的条件下于培养箱中培养；CAL-27细胞和HSC-2细胞用DMEM(10%胎牛血清）在37℃、5%CO2的条件下于培养箱中培养。
1.3细胞转染
收集对数生长期SACC-83细胞，以每孔3.5×106个细胞接种于6孔板内过夜培养。细胞分为3组：空白组、siNC组和siFGFR4组。空白组细胞不作任何处理，siNC组和siFGFR4组细胞中分别将20ng的siNC和siFGFR4质粒分别与15μL的LipofectamineTM2000混合，加入孔内，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。转染24h后，收集细胞。
1.4qRT-PCR检测FGFR4mRNA表达水平
利用TRIzol试剂提取细胞的RNA,RNA样品中加入100μL氯仿充分混匀后，4℃12000r/min离心15min，上层液体中加入新无RNA酶离心管，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃静置10min，离心10min，弃上清，加入无水乙醇清洗沉淀，重复清洗1次，弃上清，加入20μLRNase-free水溶解RNA。反转录根据qRT-PCR试剂盒说明进行。将逆转录产物进行qRT-PCR检测，反应体系为：cDNA模板2ng，上下游引物各0.4μL,SYBRPrimixExTaqTM5μL,ddH2O补充至10μL。扩增结果根据2-△△Ct法计算FGFR4mRNA的相对表达量。FGFR4上游引物序列为5'-TCCTACCTGAGGATGCTGGCCGCT-3'，下游引物序列为5'-ACCGTCGGCTCCGAAGCTGCTGCCGA-3'；β-actin上游引物序列为5'-CCGTTGCCCTGAGGCTCTTT-3'，下游引物序列为5'-GATCTGTCTGTCTTCTGTCTC-3'。
1.5免疫印迹检测FGFR4、Bcl-2、Bax、RAS、p-MEK和p-ERK1蛋白表达水平
将RIPA裂解液加入细胞中裂解蛋白，利用BCA法检测细胞蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离等量蛋白后转膜。利用5%脱脂牛奶4℃封闭1h，加鼠抗人的Bcl-2、Bax、RAS、RAF、MEK、p-MEK、ERK1、p-ERK1抗体（1∶2000）和FGFR4抗体摇床4℃孵育过夜，TBST洗膜5min,4次，加入HRP标记的兔抗鼠二抗（1∶1500)37℃孵育1h,TBST洗膜5min,4次。显影曝光后，通过ImageProPlus系统分析蛋白条带灰度值，计算（目的蛋白/β-actin）的比值。
1.6免疫组织化学检测FGFR4的表达
将获得的肿瘤组织样本和癌旁非肿瘤组织进行常规石蜡切片，切片脱蜡后蒸馏水浸洗1min后，对切片进行抗原修复，滴加3%的过氧化氢于切片组织上，室温孵育10min,PBS冲洗5次，每次2min。滴加稀释好的山羊血清，孵育40min，去除玻片周围液体，滴加鼠抗人FGFR4抗体，置于4℃孵育过夜。PBS冲洗切片5次，每次2min，去除玻片周围液体，滴加二抗37℃孵育25min。PBS冲洗切片，滴加DAB显色液，自来水冲洗终止染色后，Harris苏木精复染45s，水洗后用1%的盐酸乙醇分化，再用自来水水洗返蓝。将切片置于无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ脱水后，平置于通风橱晾干，镜检拍照。
1.7克隆形成实验检测SACC-83细胞的增殖
胰蛋白酶消化对数生长期细胞，完全培养基重悬细胞后计数。以每孔800个细胞接种于6孔板内，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每3d更换培养基并观察细胞，在6孔板底部对单克隆细胞标记。培养8d后观察细胞，弃上清，PBS洗涤细胞，加入1mL4%多聚甲醛，4℃固定细胞1h,PBS洗涤细胞，加入1000μL结晶紫染色液作用细胞2min,ddH2O洗涤细胞，选取肿瘤丰富的区域，置于200×高倍镜，胞质或细胞核染成棕黄色表示为阳性细胞，200×镜下计数400个肿瘤细胞中阳性细胞数，统计数值：阳性细胞数/肿瘤细胞数×100%，重复5次后取平均值。
1.8流式细胞术检测SACC-83细胞凋亡和细胞周期
将转染siRNA24h的SACC-83细胞胰蛋白酶消化，离心收集细胞后利用冰预冷的PBS洗涤细胞。在避光条件下，加入FITC-AnnexinV和碘化丙钠（PI），静置15min后，加入BindingBuffer混匀置于冰上，利用流式细胞仪检测细胞凋亡。收集人口腔鳞癌细胞SACC-83，调整细胞数目为106/mL，加入70%乙醇固定细胞，PBS洗涤细胞后，离心去除上清，加入RNase37℃孵育30min，加入碘化丙啶（PI），孵育15min，利用流式细胞仪分析细胞周期。
1.9统计学处理
采用SPSS20.0软件进行分析，符合正态分布的数据采用±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1FGFR4在口腔鳞癌组织及口腔鳞癌细胞中的表达
32对样本的免疫组织化学显色结果显示，FGFR4在正常口腔上皮组织中表达微弱，但在口腔鳞癌组织中过度表达（图1A）。与免疫组织化学染色结果一致，免疫印迹检测显示，肿瘤组织中的FGFR4蛋白水平高于相应的非癌组织（图1B）。此外，与正常口腔上皮细胞HOEC相比，在口腔鳞癌细胞系（HSC-2、CAL-27和SACC-83）中检测到不同程度的FGFR4过表达（P<0.01）（图1C、D）。SACC-83细胞系中的FGFR4蛋白表达水平较高，可作为以下研究基础。
2.2沉默FGFR4基因对口腔鳞癌细胞增殖的影响
为了研究FGFR4对口腔鳞癌细胞增殖的影响，将FGFR4siRNA转染SACC-83细胞24h后进行qRT-PCR、免疫印迹和克隆形成实验。qRT-PCR实验结果显示，与siNC组（0.987±0.061）相比，siFGFR4组（0.305±0.015）的FGFR4mRNA相对表达量显著降低（P<0.01）；免疫印迹检测结果显示，si-FGFR4组的FGFR4蛋白表达水平明显低于siNC组，说明siRNA可以有效抑制FGFR4的表达。克隆形成实验检测沉默FGFR4基因对SACC-83细胞增殖的影响，结果显示，与siNC组相比，si-FGFR4组细胞克隆数减少约40.6%(P<0.01）。
2.3沉默FGFR4基因对口腔鳞癌细胞凋亡的影响
为了研究FGFR4对口腔鳞癌细胞凋亡的影响，对已转染FGFR4siRNA的SACC-83细胞进行流式细胞术检测。流式细胞术检测结果显示，与siNC组相比，si-FGFR4组细胞凋亡数目增加（P<0.01）（图3A、B）。免疫印迹检测结果显示，与siNC组相比[Bcl-2表达量为（0.812±0.120),Bax表达量为（0.469±0.060）]，沉默FGFR4抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（0.378±0.080)(P<0.01），上调凋亡蛋白Bax的表达（0.885±0.090)(P<0.01）。
2.4沉默FGFR4基因对口腔鳞癌细胞周期的影响
为了研究FGFR4基因对口腔鳞癌细胞周期的影响，对已转染FGFR4siRNA的SACC-83细胞进行流式细胞术检测。实验结果显示，与siNC组相比，转染siFGFR4使SACC-83细胞在G0/G1期停滞（。免疫印迹检测结果显示，沉默FGFR4抑制周期蛋白P21的表达（P<0.05）（图4B）。
2.5沉默FGFR4基因抑制RAS/RAF/MAPK信号通路
为了研究沉默FGFR4对RAS/RAF/MAPK信号通路的影响，将收集的已转染FGFR4siRNA的SACC-83细胞进行免疫印迹检测。结果显示，siNC组的EGFR表达量为（0.732±0.210）、RAS为（0.634±0.080）、RAF为（0.601±0.680）、p-MEK/MEK为（0.768±0.410）、p-ERK1/ERK1为（0.753±0.540);si-FGFR4组的EGFR(0.197±0.280),RAS表达量为（0.317±0.720）、RAF为（0.309±0.620）、p-MEK/MEK为（0.409±0.320）和p-ERK1/ERK1为（0.325±0.080）；较siNC组显著降低（P<0.05），说明沉默FGFR4基因可抑制RAS/RAF/MAPK信号通路。
在口腔鳞癌组织和口腔鳞癌细胞系中的表达，标尺=100μm。A：免疫组织化学检测FGFR4的表达；B、C：免疫印迹检测FGFR4的表达；D:FGFR4/β-actin比值，P<0.01vsHOEC.
沉默FGFR4对口腔鳞癌细胞SACC-83增殖的影响。A、B:SACC-83细胞分别瞬时转染NCsiRNA和FGFR4siRNA，提取总RNA和细胞溶解产物在转染后24h内，用qRT-PCR和免疫印迹检测FGFR4在mRNA和蛋白水平的表达（P<0.01vssiNC);C、D：克隆形成实验检测FGFR4沉默后SACC-83细胞增殖能力，P<0.01vssiNC.
沉默FGFR4对口腔鳞癌细胞SACC-83的凋亡影响。A、B：流式细胞术检测FGFR4对SACC-83细胞凋亡的影响（P<0.01vssiNC);C、D：免疫印迹检测抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡相关蛋白Bax蛋白的表达（**P<0.01vssiNC).
A：流式细胞术检测FGFR4对SACC-83细胞周期的影响（与siNC相比）；B：免疫印迹检测细胞周期蛋白P21蛋白的相对表达量（P<0.05vssiNC)
3讨论
口腔鳞癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，发病率约占头颈部鳞状细胞癌的40%。与其他恶性肿瘤相比，口腔鳞癌的生存指数低、预后复发和转移概率较高。根据世界卫生组织数据显示，每年口腔鳞癌的死亡人数高达14.5万。尽管在预防和治疗方面已取得相应进展，但口腔鳞癌诊断的延误仍然是高发病率和高死亡率的主要原因之一。因而，探究抑制口腔鳞癌细胞增殖和迁移的分子机制，是解决当前临床口腔鳞癌防治的关键之一。
FGFR4是高度保守的酪氨酸激酶受体家族成员之一，由一个细胞配体结构域、单跨膜螺旋结构域和具有酪氨酸激酶活性的细胞质结构域组成。在癌症中，FGFR4基因异常会影响FGFR4蛋白的下游信号通路，导致持续的细胞增殖，促进肿瘤的发生发展。研究表明，FGFR4是肝细胞癌的驱动因素,FGFR4可增加肺腺癌中表皮生长因子受体（EGFR）的致癌信号，阻断FGFR4可显著抑制ESCC的恶性行为[20]。此外，FGFR4在乳腺癌细胞中过表达，是引起肿瘤细胞恶性生物学行为的原因]。这些研究表明，FGFR4可能是一个促癌因子。Choi等报道FGFR4单核苷酸多态性可作为预测口腔鳞癌淋巴结转移的因素；Chia-Hsuan等报道FGFR4的多态性与口腔鳞癌的易感性相关。这说明FGFR4可能与口腔鳞癌的发生发展相关。然而，目前FGFR4与口腔鳞癌发生发展的相关分子机制的研究报道甚少。本研究结果显示，FGFR4在口腔鳞癌组织样本和细胞系中显著高表达，暗示FGFR4的高表达与口腔鳞癌细胞的发生发展过程相关。研究显示下调FGFR4表达，会抑制口腔鳞癌细胞SACC-83的增殖，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进凋亡相关蛋白Bax的表达，细胞凋亡的数目增加；此外，P21蛋白表达降低。P21是调控细胞周期的主要蛋白，通过与增殖细胞核抗原结合，抑制DNA聚合酶复合物的形成，进而影响细胞复制，阻滞细胞周期，特别是G0/G1期[24]。本研究证实，下调FGFR4表达，使SACC-83细胞停滞于G0/G1期。这说明在口腔鳞癌细胞SACC-83中，下调FGFR4表达具有抑制其细胞增殖，促进细胞凋亡的作用。本研究结果表明，FGFR4在口腔鳞癌细胞SACC-83中发挥的功能与其在乳腺癌、肝癌、肺腺癌等癌症中的生物学功能一致，具有明显的促癌作用。
沉默FGFR4对RAS/RAF/MAPK信号通路影响免疫印迹检测EGFR、RAS、RAF、p-MEK、MEK、p-ERK1和ERK1蛋白的表达，*P<0.05vssiNC
研究表明，肿瘤细胞中过表达的FGFR4和Klotho蛋白结合，与FGFR19组成同源二聚体复合物，随后激活RAS/RAF/MAPK信号通路，最终导致肿瘤细胞的增殖和迁移。已有研究显示，RAS/RAF/MAPK信号通路与乳腺癌和直肠癌的发生发展相关。白玥等[28]报道甲氨蝶呤通过RAS/MAPK信号通路抑制胶质母细胞瘤的生长；候晓洁等[29]报道华蟾毒配基联合索拉非尼通过AURKA/RAS/RAF/ERK信号通路影响肝癌Huh7细胞增殖与凋亡。这些研究表明，RAS/RAF/MAPK信号通路参与肿瘤发生发展和恶性转化过程。本研究结果显示，在口腔鳞癌细胞中下调FGFR4，降低RAS、p-RAF和p-ERK1/2蛋白的表达，提示下调FGFR4的表达抑制口腔鳞癌中RAS/RAF/MAPK信号通路的活化。之前的研究显示，RAS/RAF/MAPK在胶质母细胞瘤、肝癌、乳腺癌和直肠癌发展过程中被异常激活，而本研究的实验结果提示，在口腔鳞癌细胞SACC-83中RAS/RAF/MAPK通路同样被激活，也可能参与了癌细胞的发展，进一步表明抑制该通路活化有可能成为癌细胞靶向治疗的关键。
广东医学教育网指出，FGFR4在口腔鳞癌组织和口腔鳞癌细胞中高表达，下调FGFR4可抑制RAS/RAF/MAPK信号通路的激活，进而抑制口腔鳞癌细胞增殖，使细胞周期停滞于G0/G1期，促进其凋亡。以上结果初步明确FGFR4在口腔鳞癌进展中发挥重要作用，为进一步探索口腔鳞癌的发生发展机制提供新的思路。
来源：广东医学教育网